Introducción
En la última década, el desarrollo de nuevos antibióticos ha disminuido significativamente, lo que representa un problema con consecuencias potencialmente devastadoras. La resistencia bacteriana se reconoce ahora como un problema global, que afecta a personas de todas las edades y países1. La resistencia a los antibióticos prolonga las estancias hospitalarias, incrementa los costos médicos y eleva las tasas de mortalidad. Además, los estudios sobre resistencia bacteriana en la comunidad son significativamente menos numerosos en comparación con los realizados en hospitales, a pesar del aumento de la resistencia en todos los sectores a nivel global. Estos patrones de resistencia impactan gravemente en el tratamiento de infecciones adquiridas en la comunidad. Por ejemplo, las infecciones urinarias causadas por Escherichia coli o las infecciones respiratorias por Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae pueden dejar de responder a los antibióticos comúnmente usados, lo que obliga a utilizar terapias más complejas y costosas2.
Entre los mecanismos utilizados por estas bacterias está la producción de una clase de enzimas conocidas como β-lactamasas, que juegan un papel clave en la resistencia antimicrobiana. Estas enzimas son capaces de hidrolizar la acción del antibiótico, permitiendo que las bacterias sobrevivan, se multipliquen y provoquen infecciones más graves3. La expresión de múltiples β-lactamasas en una sola especie bacteriana es un fenómeno alarmante, ya que puede hacer que el tratamiento de infecciones sea extremadamente difícil. Una de las subclases enzimáticas más preocupantes es la CTX-M, enzima codificada por el gen del mismo nombre, que se ha convertido en uno de los principales factores de resistencia bacteriana4.
Los microorganismos productores de β-lactamasas CTX-M son especialmente preocupantes, ya que han desarrollado una alarmante resistencia a una amplia gama de agentes antibacterianos, incluyendo penicilinas, cefalosporinas de amplio espectro y oximino-cefalosporinas como ceftazidima, cefotaxima, ceftriaxona y cefepima5. La reciente propagación de los genes que codifican estas enzimas, localizados en plásmidos, ha supuesto una amenaza significativa para la eficacia clínica de las cefalosporinas de espectro extendido, comprometiendo la capacidad del sistema de salud para tratar eficazmente las infecciones bacterianas6. El objetivo de este estudio fue identificar la presencia del gen CTX-M en cepas bacterianas aisladas de urocultivos y determinar las variantes específicas de dicho gen.
Método
Se utilizó una colección bacteriana de uropatógenos compuesta por 60 cepas bacterianas gramnegativas, procedente de infecciones urinarias del ámbito comunitario que habían ido procesadas por recuento microbiológico ≥ 100.000 UFC/ml que presentaban el mecanismo de resistencia tipo β-lactamasas de espectro extendido (BLEE). Estas cepas están almacenadas a –80 °C y forman parte de la colección biológica tipo cepario del Laboratorio de Epidemiología Molecular de la Universidad de Boyacá, en Colombia. Estas cepas están registradas en el Registro Único Nacional de Colecciones, administrado por el Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt, bajo el número 274.
Las cepas se reactivaron inoculándolas en caldo Brain Heart Infusion e incubándolas a 37 °C con agitación durante 24 horas para obtener un cultivo bacteriano preenriquecido. Posteriormente, se sembraron en agar MacConkey, medio selectivo para microorganismos gramnegativos. Cada colonia aislada fue sometida a tinción de Gram para confirmar que sus características morfológicas correspondían a bacterias gramnegativas.
Tras la confirmación microbiológica convencional, se realizó la caracterización molecular, iniciando con la extracción de ADN de las cepas mediante el kit Wizard de purificación de ADN genómico de Promega. Luego se cuantificó el ADN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop. Se consideraron relaciones A260/A280 aceptables entre 1.8 y 2.0, y una concentración óptima de ADN de ≥ 100 μg/μl, asegurando una alta pureza del ácido nucleico.
La identificación del gen CTX-M se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) punto final, utilizando el mastermix de la marca ABM®, siguiendo el protocolo de Velandia et al.7 (Tabla 1). Para la visualización se empleó un marcador de peso molecular de 1 Kb (ABM®). Una muestra previamente secuenciada sirvió como control positivo, y agua grado biología molecular como control negativo.
Tabla 1. Protocolo de amplificación del gen CTX-M
| Gen | Secuencia (5’- 3’) | Tamaño (pb) | Desnaturalización Temperatura | Ciclos | Alineamiento Temperatura | Extensión Temperatura | Extensión final Temperatura |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CTX-M | 5´ GACGATGTCACTGGCTGAGC3´ 5´AGCCGCCGACGCTAATAC3´ | 500 | 94 ºC 30 s | 35 | 58 °C 1 min | 72 ºC 1 min | 72 ºC 10 min |
Después de la PCR, se llevó a cabo la electroforesis. Se preparó un gel de agarosa al 1% y la corrida se programó por 60 minutos a 45 voltios (Tabla 1).
Las muestras que mostraron amplificación del gen CTX-M se enviaron a secuenciación mediante el método Sanger. Cada resultado incluyó tres archivos: un archivo de texto plano (.txt), un archivo FASTA con la secuencia nucleotídica y un archivo SCF, que contiene tanto la secuencia como los picos del electroferograma, lo cual permite su visualización mediante cromatogramas.
El software FinchTV versión 1.5.0 se utilizó para leer los cromatogramas y visualizar las secuencias de ADN, evaluando la calidad de estas. Una vez verificada, se realizó un alineamiento mediante BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool for nucleotides) para comparar las secuencias obtenidas con las bases de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y la NDARO (National Database of Antibiotic Resistant Organisms). Finalmente, se construyó un dendrograma con los métodos Neighbor-Joining y Maximum Composite Likelihood, con 1.000 réplicas bootstrap, usando el software MEGA versión 12.0. Se incluyeron variantes asociadas a ITU adquiridas en la comunidad (Tabla 2) y se determinó la relación purinas/pirimidinas.
Tabla 2. Código de referencia y variantes registradas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI)
| Variante | Código de referencia |
|---|---|
| blaCTX-M1 | NG_048897.1 |
| blaCTX-M3 | NG_048979.1 |
| blaCTX-M10 | NG_048898.1 |
| blaCTX-M12 | NG_048913.1 |
| blaCTX-M2 | NG_048968.1 |
| blaCTX-M8 | NG_049032.1 |
| blaCTX-M14 | NG_048929.1 |
| blaCTX-M4 | NG_048990.1 |
| blaCTX-M5 | NG_049000.1 |
| blaCTX-M6 | NG_049010.1 |
| blaCTX-M16 | NG_048944.1 |
| blaCTX-M27 | NG_048976.1 |
| blaCTX-M25 | NG_048974.1 |
| blaCTX-M26 | NG_048975.1 |
| blaCTX-M39 | NG_048989.1 |
Resultados
La confirmación microbiológica identificó 56 muestras como bacterias gramnegativas, todas con fenotipo BLEE. Se observó amplificación del gen CTX-M en el 51% (n = 29) de las cepas. Los resultados de la secuenciación mostraron que solo el 2% (n = 1) de las cepas de origen comunitario portaban el gen, correspondiendo a la variante CTX-M-15 de E. coli, con un 82,89% de similitud. La composición nucleotídica mostró un 45,8% de purinas y un 54,2% de pirimidinas.
En el árbol se identificaron los siguientes grupos monofiléticos, que incluyen todas las variantes descendientes de un ancestro común: grupo 1 incluidos CTX-M-25, CTX-M-39, CTX-M-26 y CTX-M-8; grupo 2 incluidos CTX-M-16 y CTX-M-27; grupo 3 incluidos CTX-M-2, CTX-M-5, CTX-M-14 y CTX-M-6, y grupo 4 incluidos CTX-M-7, CTX-M-32, CTX-M-13 y CTX-M-21 (Fig. 1).
Figura 1. Dendrograma de variantes del gen CTX-M. El dendrograma permite hacer inferencias sobre el proceso evolutivo en términos de agrupaciones monofiléticas, parafiléticas y polifiléticas, ayudando a entender las relaciones evolutivas entre variantes de CTX-M y la posición de la muestra.
A partir del dendrograma pueden hacerse inferencias sobre el proceso evolutivo en términos de agrupaciones monofiléticas, parafiléticas y polifiléticas, lo cual ayuda a comprender las relaciones evolutivas entre las variantes CTX-M y la posición de la muestra. El árbol muestra los siguientes grupos monofiléticos, ya que incluyen todas las variantes que descienden de un ancestro común: grupo 1, CTX-M-25, CTX-M-39, CTX-M-26 y CTX-M-8; grupo 2, CTX-M-16 y CTX-M-27; grupo 3, CTX-M-2, CTX-M-5, CTX-M-14 y CTX-M-6, y grupo 4, CTX-M-7, CTX-M-32, CTX-M-13 y CTX-M-21.
Los siguientes son grupos parafiléticos, los cuales incluyen un ancestro común pero no a todos sus descendientes. El grupo 5 está compuesto por CTX-M-12, CTX-M-10, CTX-M-1 y CTX-M-3, la muestra analizada, que se encuentra dentro de este grupo. Sin embargo, su posición exacta sugiere que el grupo no incluye todas las variantes que comparten el mismo ancestro. Esta agrupación indica que la muestra comparte una relación evolutiva más cercana con estos genes y puede haberse originado a partir de un ancestro común con CTX-M-128.
Dentro del dendrograma, no parece haber grupos polifiléticos, ya que todos los clústeres parecen derivar de un ancestro común. En otras palabras, no se incluyen organismos que compartan rasgos similares debido a evolución convergente o adaptación similar, pero que no compartan un ancestro común reciente9.
Discusión
Durante su evolución, las bacterias han desarrollado mecanismos cada vez más complejos para evadir los antibióticos. Uno de ellos es la resistencia adquirida, que refiere a la capacidad de algunas cepas de volverse resistentes, aunque la especie como tal sea susceptible10.
La resistencia bacteriana a los antibióticos es un problema de salud pública global, agravado por el uso inapropiado de antimicrobianos y la capacidad de las bacterias para adquirir genes de resistencia. En este contexto, las BLEE, especialmente las enzimas CTX-M, son importantes por su capacidad de inactivar cefalosporinas de tercera generación y diseminarse rápidamente entre distintas especies bacterianas11.
Las enzimas CTX-M, de clase A de Ambler, se encuentran comúnmente en bacterias gramnegativas como E. coli y Klebsiella spp., y están codificadas en plásmidos móviles, lo que facilita su diseminación9. En América, estas enzimas son endémicas, con alta prevalencia tanto en hospitales como en la comunidad. En este estudio, el 48,3% de las cepas aisladas fueron positivas para el gen CTX-M y el 3,44% correspondió a la variante CTX-M-15, en concordancia con la literatura nacional e internacional12,13.
Estudios de Cornejo et al.14, Bali et al.15 y Pulido et al.16 muestran alta prevalencia del gen CTX-M en K. pneumoniae y E. coli, superando el 90% en algunos hospitales. Se destaca también su presencia en infecciones comunitarias, incluso en pacientes sin antecedentes de hospitalización. También se resalta la importancia de las infecciones adquiridas en la comunidad, donde se han identificado cepas portadoras del gen CTX-M en pacientes sin antecedentes de hospitalización, lo que demuestra que la resistencia no es exclusiva de los entornos clínicos.
Las variantes de CTX-M se agrupan en seis grupos principales con distribución global. CTX-M-15 es la más prevalente, sobre todo en E. coli asociada a ITU. Otras variantes como CTX-M-1, CTX-M-2 y CTX-M-14 también se han detectado, con patrones geográficos distintos, compartiendo similitudes estructurales en aminoácidos conservados, lo que permite su clasificación filogenética11.
Estudios de Ruppé et al.17 y Woodford et al.18 reportan alta prevalencia de CTX-M-15 en ITU comunitarias y su asociación con clones epidémicos como ST131 en E. coli. En Colombia, trabajos de Leal et al.19 y Velandia et al.7 confirman la circulación de estas variantes, incluyendo Boyacá.
Aunque los estudios comparados usaron más cepas, principalmente hospitalarias, los hallazgos de este trabajo reflejan la misma tendencia de diseminación de genes como CTX-M tanto en entornos comunitarios como clínicos. La automedicación, prescripción inadecuada y posible mala calidad de medicamentos contribuyen al problema18.
Conclusión
La resistencia tipo BLEE representa un gran desafío sanitario. Por tanto, es urgente entender sus patrones de diseminación y trayectoria evolutiva. La presencia del gen CTX-M y sus variantes, especialmente CTX-M-15, supone una amenaza creciente por su rápida propagación e impacto en infecciones comunes como las ITU. Su detección y caracterización molecular son esenciales para implementar estrategias de vigilancia y control eficaces, tanto en hospitales como en la comunidad.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los laboratorios de la Universidad de Boyacá por la infraestructura y apoyo brindado durante la investigación. También expresan su gratitud al Semillero de Investigación en Resistencia Antimicrobiana por su valiosa colaboración y compromiso.
Financiamiento
Los autores declaran que esta investigación fue financiada por la Universidad de Boyacá.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
Consideraciones éticas
Protección de personas y animales. Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.
Confidencialidad, consentimiento informado y aprobación ética. El estudio no involucra datos personales, historias clínicas ni muestras biológicas humanas, por lo que no requiere aprobación ética. No se aplican las guías SAGER.
Declaración sobre el uso de inteligencia artificial (IA). Los autores declaran que se utilizó una herramienta de inteligencia artificial para la redacción o soporte del manuscrito.
- – ChatGPT.
- – Ajuste de redacción de texto y estilo, asi como en la tradución del resumen.
